EKSPRESI MATERI GENETIK

Transkripsi

Transkripsi merupakan pengkopian daerah pengkode pada DNA menjadi RNA untai tunggal (Lodish, 2005), pengertian ini diperjelas lagi dengan definisi transkripsi yang dijelaskan dalam Wikipedia (2010) bahwa, transkripsi adalah pembuatan RNA dengan menyalin sebagian berkas DNA, transkripsi merupakan bagian dari rangkaian ekspresi genetik. Pengertian asli "transkripsi" adalah alih aksara atau penyalinan. Di sini, yang dimaksud adalah mengubah "teks" DNA menjadi RNA. Sebenarnya, yang berubah hanyalah basa nitrogen timin di DNA yang pada RNA digantikan oleh urasil.

Kata transkripsi berasal dari bahasa Inggris transcription atau bahasa latin transcriptio yang berarti penyalinan atau perekaman. Secara fungsional, transkripsi diartikan sebagai transfer informasi genetik yang terdapat dalam urut-urutan nukleotida DNA menuju ke urut-urutan nukleotida RNA (Ayala, 1984 dalam Corebima, 2002); atau penyalinan atau perekaman informasi genetik yang ada pada DNA (berupa urutan nukleotida) yang menghasilkan salinan atau rekaman berupa urutan nukleotida RNA dan menggunakan DNA sebagai template (cetakannya) (Corebima, 2002).

Ditambahkan lagi dengan penjelasan dari Wiguna, bahwa transkripsi berlangsung di dalam inti sel (nukleus) atau di dalam matriks pada mitokondria dan plastida. Transkripsi dapat dipicu oleh rangsangan dari luar maupun tanpa rangsangan. Pada proses tanpa rangsangan, transkripsi berlangsung terus-menerus (gen-gennya disebut gen konstitutif atau "gen pengurus rumah", house-keeping genes). Sementara itu, gen yang memerlukan rangsangan biasanya gen yang hanya diproduksi sewaktu-waktu; gen-nya disebut gen regulatorik karena biasanya mengatur mekanisme khusus. Rangsangan akan mengaktifkan bagian promoter. Promoter ini terletak di sebelah hulu bagian yang akan disalin (disebut transcription unit) 

B.       Tinjauan Umum tentang Transkripsi

Menurut Gardner dkk (1991) dalam Corebima (2002), terdapat satu atau lebih gen yang berperan dalam pembentukan tiap enzim. Dalam biologi molekuler terdapat dogma sentral yang meringkas pola perjalanan ekspresi gen hingga membentuk enzim (protein). Dogma sentral yang dikemukakan oleh Crick digambarkan sebagai berikut.

Gambar 2.1 Model dogma sentral mula-mula oleh Crick (Tamarin dkk, 2001)

Dogma sentral tentang pembentukan protein tersebut menunjukkan bahwa urut-urutan terbentuknya protein adalah dari DNA mengalami transkripsi menjadi RNA dan mengalami translasi membentuk protein. Bagan tersebut memberikan gambaran yang jelas bagaimana gen sangat berperan dalam menentukan fenotipe suatu organisme.

Akan tetapi, dengan berkembangnya ilmu genetika dan ditemukannya beberapa fakta baru tentang aktifitas materi genetik, diantaranya tentang fenomena transkripsi balik maupun replikasi RNA. Maka model dogma sentralpun disempurnakan, sebagaimana yang tampak pada gambar yang telah disesuaikan berikut:

Gambar 2.2   Model dogma sentral yang telah mengalami penyempurnaan (Tamarin dkk, 2001)

Sebagaimana dibahas sebelumnya, bahwa dalam transfer informasi genetik dari DNA ditranskripsikan menjadi RNA, namun kita tahu bahwa DNA merupakan untai ganda sedangkan RNA hanya memiliki untai tunggal. Untuk menjawab pertanyaan tersebut dijelaskan pada Gardner dkk (1991) dalam Corebima (2002) bahwa transkripsi terjadi hanya pada satu untaian DNA saja, yang disebut untai sense (sense strand), gen-gen yang berbeda mungkin memiliki untai sense yang berbeda pula. Artinya rantai mana yang dibaca sebagai sense akan berbeda untuk gen-gen yang berbeda.

Gen yang lengkap terdiri dari 3 bagian utama: (1) daerah pengendali (regulatory region) yang disebut promoter yang terletak pada ujung 5’, (2) bagian struktural gen yang berisi urutan DNA yang akan ditranskripsikan, dan (3) bagian terminator yang terletak di hilir (downstream) daerah struktural.  Dalam proses transkripsi, DNA akan diterjemahkan menjadi kode-kode dalam bentuk RNA. Ada 3 macam RNA hasil transkripsi DNA, yaitu mRNA, tRNA dan rRNA. Molekul tRNA dan rRNA nantinya tidak memasuki tahap translasi, melainkan tetap dalam bentuk RNA karena molekul yang digunakan adalah RNA itu sendiri (Yuwono, 2008).

Di dalam proses transkripsi, terdapat beberapa komponen yang terlibat yaitu (1) urutan DNA yang akan ditranskripsi, (2) enzim RNA polimerase, (3) faktor-faktor transkripsi, (4) prekursor untuk sintesis RNA (Yuwono, 2008).

Enzim RNA polimerase atau RNA transcriptase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi nukleotida pada RNA. Pada E. coli, (prokariotik) gennya ditranskripsi menggunakan satu tipe RNA polimerase (Brown, 1989 dalam Corebima, 2002) sedangkan pada eukariot, terdapat tiga tipe RNA polimerase, yaitu RNA polimerase I, RNA polimerase II dan RNA polimerase III. Menurut Corebima (2002), terdapat perbedaan RNA polimerase berdasarkan tipe gen yang ditranskripsikan dan proporsi seluruh aktivitas transkripsi, sebagaimana dijabarkan dalam tabel berikut:

RNA Polimerase	Tipe gen yang ditanskripsikan	Proporsi seluruh aktivitas transkripsi (%)	Letak dalam sel	Sensitivitas Terhadap Amanita phalloides
I	Gen-gen RNA-r (28S, 18S, dan 5S)	60	Nukleolus	Tidak sensitif
II	Terutama gen-gen yang mengkode protein, atau secara rinci: hnRna, RNA-d dan beberapa RNA-m	10	Nukleoplasma	Sangat sensitif
III	Gen-gen RNA-t, gen-gen RNA-r 5S, dan beberapa snRNA*	10	Nukleoplasma	Cukup sensitif

Catatan : snRNA = small nuclear RNA       

(diadaptasi dari Brown, 1989 dan Russel, 1994 oleh Corebima, 2002)

                                

Tabel 2.1   Aktivitas tiga macam RNA polimerase pada

sel-sel makhluk hidup eukariotik

2.1    Transkripsi pada Prokariot

Transkripsi berlangsung dalam tiga tahap, yaitu: tahap inisiasi, elongasi dan terminasi (Campbell dkk., 2002; Brown dalam Corebima, 2002).

Yuwono (2008) menyebutkan bahwa pada umumnya, gen yang mengkode protein pada prokariot adalah gen dengan kopi tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupa gen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Organisasi gen dalam organisme prokariot disebut operon. Suatu operon adalah organisasi beberapa gen struktural yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama.

Contoh dari operon adalah lac operon, operon yang mengendalikan kemampuan metabolisme pada E. coli. Terdapat 3 macam gen dalam lac operon, yaitu gen Z (mengkode β-galaktosidase), gen Y (mengkode permease), dan gen A (mengkode trans-asetilase). Masing-masing gen struktural memiliki kodon inisiasi awal dan kodon terminasi, tetapi ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Pada saat transkripsi, terbentuk 1 RNAd yang membawa kodon untuk 3 macam polipeptida yang berbeda (polisistronik). Masing-masing polipeptida akan ditranslasi secara independen dari satu untaian RNAd yang sama (Yuwono, 2008). 

Beikut penjelasan lebih lanjut tentang tahapan-tahapan dalam proses transkripsi,

A.      Inisiasi

Tahap inisiasi berupa pengenalan holoenzyme (RNA polimerase) pada tapak awal inisiasi atau yang disebut sebagai promoter. Pengenalan promoter ini berlangsung melalui pelekatan/pengikatan holoenzyme (RNA polimerase) pada posisi promoter. Bagian RNA polimerase yang mengenali promoter adalah subunit τ (sigma) (Corebima, 2002). 

Semua promoter mempunyai urut-urutan nukleotida yang sama atau sangat mirip. Pada E. coli diketahui ada dua macam urut-urutan promoter yaitu 5'-TTGACA-3' (-35box) dan 5'-TATAAT-3' (-10 box atau Pribnow box). -10 menunjuk pada lokasi box tersebut terdapat berkaitan dengan posisi awal transkripsi. (Ayala, dkk., 1984; Freifelder, 1985; Brown, 1989; Klug, dkk., 1994 dalam Corebima, 2002).

Pada awal proses pengikatan RNA polimerase (holoenzime) dengan promoter disebut sebagai "kompleks promoter yang tertutup" atau Closed promoter complex (Brown, 1989 dalam Corebima, 2002). Dalam bentuk closed promoter complex, enzim polimerase menutupi atau "melindungi" sekitar 60 bp (base pairs) dari heliks ganda, bermula dari posisi di depan (upstream) -35 box menuju ke arah -10 box. Diduga holoenzyme RNA polimerase secara khusus mengenali -35 box sebagai tapak pengikatan DNA, meskipun kesimpulan ini masih kontroversial. Akan tetapi dinyatakan lagi, bahwa -10 box adalah daerah yang jelas-jelas merupakan tempat pemutusan ikatan hidrogen antara basa (yang disebut peleburan), maupun tempat pertama terbukanya lilitan heliks ganda DNA (Corebima, 2002).

Setelah RNA polimerase berlekatan dengan bagian promoter, selanjutnya akan membentuk formasi open promoter complex, yakni struktur yang terbentuk akibat pemutusan ikatan hidrogen maupun terbukanya lilitan heliks. Dengan terbentuknya open promoter complex tersebut memungkinkan terjadinya proses polimerisasi RNA, setelah terlebih dahulu berlangsung polimerisasi pertama yang menghadirkan dua nukleotida yang pertama.

B.       Elongasi

Setelah tahap inisiasi selesai, maka dilanjutkan dengan tahap elongasi. Selama tahap elongasi, RNA polimerase (core enzyme) memutuskan ikatan hidrogen, serta membuka lilitan heliks ganda. RNA polimerase bergerak sepanjang molekul DNA dan menghubungkan ribonukleotida-ribonukleotida ke ujung 3^’ pada molekul RNA yang sedang tumbuh, sesuai dengan macam basa pada DNA yang menjadi cetakannya (Brown 1989 dalam Corebima, 2002). Proses ini berlangsung dengan arah polimerisasi dari ujung  5^’ ke ujung 3^’.

Selama berlangsungnya polimerisasi, bagian molekul RNA yang telah terbentuk, secara bertahap terlepas ikatannya dari untaian DNA pengkode, sehingga memungkinkan segera terbentuknya kembali heliks ganda seperti semula. Dalam hubungan ini bagian DNA yang terbuka, atau yang disebut "gelembung transkripsi" hanya mengandung pasangan basa RNA-DNA sejumlah antara 12 sampai 17 (Corebima, 2002).

C.       Terminasi

Proses elongasi pada akhirnya harus dihentikan, penghentian ini dinamakan terminasi. Menurut Yuwono (2008), proses terminasi transkripsi pada prokariot dapat dikelompokkan menjadi 2 kelas, yaitu: (1) terminasi yang ditentukan oleh urutan nukleotida tertentu (rho-independent) dan (2) terminasi yang diatur oleh suatu protein (faktor ρ) (rho-dependent). Kelas pertama dicirikan oleh struktur jepit rambut dan lengkung. Dewasa ini diketahui adanya perbedaan struktur antara terminasi yang tergantung pada faktor ρ (dependent terminator), dan yang tidak tergantung pada faktor ρ atau ρ-independent terminator (Brown, 1989). Dalam hal ini struktur terminator yang tidak tergantung pada faktor ρ memiliki suatu seri pasangan basa A-T langsung mengikuti palindrom. Pasangan basa A-T ini menyebahkan terbentuknya suatu seri 5 sampai 10 U pada ujung 3' dari RNA hasil transkripsi.

Urut-urutan proses transkripsi yang telah dibicarakan di atas, secara lengkap dapat dilihat pada gambar berikut ini.

Gambar 2.3 Proses transkripsi (www.bio.miami.edu)

Pada prokariot, translasi terjadi sebelum transkripsi sepenuhnya dirampungkan. Hal ini dimungkinkan karena pada prokariot molekul mRNA di translasikan berdasarkan arah dari ujung 5` ke ujung 3`. Selain dari itu, pada prokariot tidak terdapat membran inti, sehingga tidak ada yang memisahkan transkripsi dan translasi (sebagaimana yang terjadi pada eukariot) sehingga translasi dapat segera dilakukan (Gardner, dkk. 1991).

2.2    Transkripsi pada Eukariot

Mekanisme transkripsi secara umum pada organisme eukariot sama dengan pada prokariot, yaitu melalui tahapan inisiasi, elongasi dan terminasi. Perbedaan antara transkripsi pada eukariot dengan prokariotik adalah RNA polimerase tidak melekat pada DNA selama proses inisiasi.

Inisiasi transkripsi pada eukariot diperantarai oleh faktor-faktor transkripsi yang bersifat spesifik untuk tiap macam RNA polimerase. Segera setelah inisiasi, RNA polimerase langsung berikatan pada DNA. Ketiga macam RNA polimerase pada eukariot membutuhkan prakondisi yang berbeda untuk terlibat dalam transkripsi (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Tiga macam RNA polimerase mengenali urutan promoter yang berbeda; dan membutuhkan perangkat protein yang berbeda (disebut “faktor transkripsi” atau “transcription factor”). Berikut penjelasan dari ketiga RNA polimerase yang bekerja pada eukariot.

A.      RNA Polimerase I

Dalam Gardner (1991), dijelaskan bahwa RNA polimerase I terletak pada nukleolus dan mengkatalis pembentukan rRNA

B.       RNA Polimerase II

Masih dalam Gardner dkk (1991), dijelaskan bahwa RNA polimerasi II mentranskripsikan sebagian besar gen-gen struktural inti. RNA polimerase II ini bertanggungjawab pada pembentukan pra-mRNA.

C.       RNA Polimerase III

RNA polmerase III, sebagaimana RNA polimerase II, tidak berada di nukleolus, melainkan di nukleoplasma. RNA polimerase III ini mentranskripsikan gen-gen untuk inti kecil RNAs dan tRNAs. Tempt pelekatannya berada di antara gen-gen tersebut (Gardner dkk, 1991).

Sedikit telah disinggung di atas bahwa pada eukariot transkripsi terjadi tidak bersamaan dengan translasi. Dengan adanya membran inti, pada eukariot dapat dibedakan tempat terjadinya transkripsi dan translasi, transkripsi terjadi di dalam inti sedang translasi terjadi di sitoplasma. Waktunya pun tidak dapat terjadi secara bersamaan, sebab sebelum dapat melakukan translasi, harus merampungkan terlebih dahulu proses transkripsi. Proses transkripsi dan translasi pada eukariotpun lebih kompleks daripada prokariot (Gardner, dkk. 1991).

3.1         Kesimpulan

Dari pembahasan di dalam makalah ini, dapat disimpulkan beberapa hal, antara lain:

1)      Transkripsi merupakan pengkopian daerah pengkode pada DNA menjadi RNA untai tunggal (Lodish, 2005). Kata transkripsi berasal dari bahasa Inggris transcription atau bahasa latin transcriptio yang berarti penyalinan atau perekaman. Secara fungsional, transkripsi diartikan sebagai transfer informasi genetik yang terdapat dalam urut-urutan nukleotida DNA menuju ke urut-urutan nukleotida RNA.

2)      Dogma sentral tentang pembentukan protein menunjukkan bahwa urut-urutan terbentuknya protein adalah dari DNA mengalami transkripsi menjadi RNA dan mengalami translasi membentuk protein.

3)      Secara umum transkripsi berlangsung dalam tiga tahap, yaitu: tahap inisiasi, elongasi dan terminasi.

4)      Pada prokariot, translasi terjadi sebelum transkripsi sepenuhnya dirampungkan. Hal ini dimungkinkan karena pada prokariot molekul mRNA di translasikan berdasarkan arah dari ujung 5` ke ujung 3`. Selain dari itu, pada prokariot tidak terdapat membran inti, sehingga tidak ada yang memisahkan transkripsi dan translasi (sebagaimana yang terjadi pada eukariot) sehingga translasi dapat segera dilakukan.

5)      Dengan adanya membran inti, pada eukariot dapat dibedakan tempat terjadinya transkripsi dan translasi, transkripsi terjadi di dalam inti sedang translasi terjadi di sitoplasma. Waktunya pun tidak dapat terjadi secara bersamaan, sebab sebelum dapat melakukan translasi, harus merampungkan terlebih dahulu proses transkripsi. Proses transkripsi dan translasi pada eukariotpun lebih kompleks daripada prokariot (Gardner, dkk. 1991).

MODIFIKASI PASCA TRANSKRIPSI

Tiap unit transkripsi dapat berulang banyak kali. Karenanya, terbentuk susunan gen RNAr yang berulang. Jumlah perulangan gen RNAr bervariasi antara berbagai spesies makhluk hidup eukariotik, berkisar 100 sampai dengan 1000 kali. Misalnya pada khamir (140 unit trnskripsi), Drosophila (260 unit transkripsi) dan pada sel hela (1250 unit transkripsi).

Molekul RNAr prekursor mengandung 3 urutan RNAr serta urutan penyelanya. Urutan penyela ini disebut sebagai spacer sequences (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002).  Spacer sequences terdiri dari 2 macam, yaitu ETS (External transcribed spacer) dan ITS (internal transcribed spacer). Urutan penyela nantinya akan disingkarkan dari prekursor RNAr. Variasi ukuran panjang penyela berkaitan dengan variasi panjang unit transkripsi DNAr. Antar unit-unit transkripsi terdapat NTS (non transcribed spacer) yang terletak pada ujung 5’ maupun 3’ tiap unit transkripsi. Urut-urutan penting yang mengontrol transkripsi DNAr berada di dalam daerah NTS. Ukuran panjang NTS juga bervariasi antara spesies satu dan lainnya, misalnya katak (3-9 kb) sedangkan manusia (sekitar 90 kb).

Intron juga ditemukan pada gen RNAr organisme eukariotik tingkat rendah seperti Physarium, Tetrahymena dan Drosophila. Hasil transkripsi intron akan dipotong dari prekursor RNAr untuk menghasilkan RNAr yang siap pakai. RNA ploymerase I hanya mengkatalisis transkripsi dari unit transkripsi prekursor RNAr, sedangkan RNA polymerase II dan III dapat mengkatalisis transkripsi aneka ragam gen (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002).

Urutan promoter RNA polymerase I terletak di huulu tapak inisiasi transkripsi. Terdapat 2 daerah, yaitu (1) elemen promoter inti (core promoter element) yang terlipat menutupi titik awal transkripsi membentang dari posisi +7 hingga -45; dan (2) elemen kontrol hulu (upstream control element) yang membentang dari posisi -107 hingga -186. Pembagian daerah promoter ini terjadi pada promoter DNAr manusia sedangkan pada kodok, daerah promoternya tidak terbagi dengan jelas, hanya membentang dari posisi +6 hingga -141. Urut-urutan promoter ini khas pada tiap spesies. RNA polymerase hanya dapat mengkatalisis transkripsi gen RNAr yang berasal dari spesies berkerabat dekat pada sistem transkripsi in vitro karena berkaitan dengan faktor transkripsi yang dibutuhkan untuk transkripsi DNAr.

RNA polymerase I tidak melekat langsung pada promoter (seperti RNA polymerase III). Yang berlekatan langsung pada promoter adalah faktor-faktor transkripsi (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Pelekatan faktor transkripsi pada promoter membentuk suatu kompleks dan RNA polymerase I melekat pda kompleks tersebut. Pada manusia ditemukan 2 faktor transkripsi, yaitu hUBF (human upstream binding factor atau faktor pengikatan/pelekatan hulu manusia) melekat langsung pada kedua daerah promoter DNAr manusia dan mengaktifkan transkripsi. Protein lain, SLI, dibutuhkan untuk pengenalan promoter serta inisiasi transkripsi yang dikatalisis oleh RNA polymerase I. SLI tidak berlekatan langsung pada promoter, tetapi berinteraksi dengan promoter melalui interaksinya dengan kompleks hUBF-DNA. Apabila hUBF dan SLI sudah melekat pada promoter, maka RNA polymerase I ikut melekat dan proses transkripsi mulai berlangsung (Russle, 1992 dalam Corebima, 2002).

Terminasi prekursor RNAr bervariasi pada makhluk hidup. Pada Xenopus tedapat 2 tapak terminasi transkripsi yang penting, yaitu T2 dan T3. Tapak T2 berukuran 235 bp ke arah hilir dari ujung 3’ urutan DNAr 28S, sedangkan tapak T3 berukuran 200 bp ke arah hulu tapak inisiasi transkripsi dari unit transkripsi DNAr berikutnya. Tapak T2 dan T3 sama-sama mengandung urutan identik seukuran tujuh nukleotida yaitu  5’-GACTTGC-3’. T2 merupakan tapak primer yang digunakan untuk mengakhiri transkripsi prekursor RNAr, sedangkan T3 merupakan tapak terminasi yang aman dari kegagalan (fail-safe termination site). Unit-unit transkripsi DNAr tersusun dalam suatu deretan berjejer, maka sistem terminasi yang aman dari kegagalan tersebut memungkinkan molekul RNA polymerase secara potensial mulai beraktivitas pada satu unit transkripsi dan diteruskan ke unit transkripsi berikutnya dalam deretan tersebut (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002).

Pembentukan RNA Siap Pakai Pasca Transkripsi (Prosesing)

            Pada dasarnya, hasil transkripsi dari gen pengkode protein (RNAd), RNAt maupun RNAr dan RNAsn belum siap pakai, baik pada prokariotik maupun eukariotik. Kebanyakan RNA non ribosomal yang disintesis dalam nukleus terdiri dari molekul yang sangat besar. RNA ini merupakan bagian dari heterogenous nuclear RNA (hnRNA) dan disebut pre-mRNA.

Kebanyakan, namun tidak semua, gen pada eukariot memiliki intron (intervening sequences yaitu sekuen DNA yang tidak ditemukan komplemennya pada produk RNAd di sitoplasma) di antara ekson (expressed sequences). Gen yang tidak mengandung intron misalnya gen untuk histon dan interferon (Klug & Cummings, 1996). Transkripsi awal, karenanya mengandung semua sekuen gen. Sekuen intron dikeluarkan selama peristiwa yang disebut “prosesing”. Menurut Gardner dkk (1991) terdapat sekuen yang tetap pada semua ujung intron yaitu Ekson-GT.....(intron)....AG-ekson. Dan hal ini yang diperkirakan bertanggungjawab pada proses splicing intron.

            Splicing adalah peristiwa pengeluaran intron melalui proses pemotongan dan penggabungan kembali ekson (Gardner dkk, 1991; Russel, 1992 dalam Corebima, 2002; Klug & Cumming, 1996).

Terdapat 3 tipe berbeda pada pemotongan intron RNA:

1.      Pemotongan intron pada prekursor RNAt menggunakan endonuclease yang diikuti reaksi ligasi oleh aktivitas ligase

2.      Pemotongan intron pada prekursor rRNA secara autokatalitik dengan reaksi unik yang dimediasi oleh molekul RNA itu sendiri tanpa melibatkan aktivitas enzim

3.      Pemotongan intron hasil transkripsi nuclear pre-RNAd (hnRNA) melalui 2 tahapan reaksi yang dilakukan oleh kompleks partikel ribonucleoprotein yang dikenal sebagai spliceosome

(Gardner dkk, 1991)

Pemotongan intron dari prekursor RNAt

            Produk awal hasil transkripsi RNAt pada makhluk hidup prokariotik dan eukariotik disebut RNAt precursor atau pre-tRNA. RNAt ini lebih panjang daripada RNAt siap pakai, memiliki urutan ujung kepala (leader) pada ujung 5’ dan urutan ekor (trailer) pada ujung 3’ (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Urutan kepala dan ekor disingkirkan selama proses pembentukan RNAt siap pakai, baik pada eukariotik maupun prokariotik. Proses ini berlangsung di dalam inti pada  eukariotik. RNAt siap pakai berukuran sekitar 4S dan terdiri dari rantai tunggal berisi 75-90 nukleotida. Urutan nukleotida bervariasi bergantung pada macam RNAt.

Di kalangan makhluk hidup prokariotik, suatu kelompok gen RNAt dapat ditranskripsikan bersama menghasilkan suatu transkripsi RNA tunggal yang mengandung sejumlah urutan nukleotida RNAt. Pada akhirnya urutan 5’ kepala yang berada pada daerah spacer dan ujung 3’ akan disingkirkan.

Gardner dkk (1991) menyatakan proses penyingkiran intron RNAt ini telah dipelajari pada ragi. Proses pemotongan intron ini terjadi dalam 2 tahapan.

Tahap 1: enzim splicing endonuklease (tRNA endonuklease)  yang terikat membran nukleus memotong di dua tempat pada ujung intron prekursor RNAt menghasilkan ujung 5’OH dan 2’-3’ gugus pospat siklik pada ujung 3’.

Tahap 2: enzim splicing ligase (RNA ligase)  menghubungkan kedua ujung RNAt melalui 4 tahapan yaitu: (1) penambahan gugus pospat ke ujung 5’OH dengan bantuan kinase dan ATP; (2) gugus pospat 5’ diaktivasi melalui transfer gugus AMP ke ujung dari AMP-ligase intermediet; (3) 2’-3’ pospat siklik dibuka oleh aktivitas cyclic phosphodiesterase yang memproduksi 2’ pospat dan 3’ hidroksil bebas; (4) ligasi akhir terjadi melalui penyerangan nukleofilik 3’OH bebas ke 5’ pospat dengan pelepasan AMP. Keempat reaksi ini dikatalisis oleh splicing ligase. Proses ini terjadi pada hampir semua eukariot, kecuali pada mamalia. Perbedaan proses terjadi pada langkah keempat yaitu menghubungkan 2’-3’ ujung pospat ke ujung 5’OH.

Pemotongan intron dari prekursor rRNA 

Pada proses splicing rRNA, aktivitas splicing yang memisahkan intron dari prekursor rRNA adalah karena faktor intrinsik dalam molekul RNA itu sendiri. Proses ini disebut aktivitas autokatalitik atau self excission process (Klug & Cummings, 1996). Proses ini juga ditemukan pada sejumlah besar rRNA, RNAt, dan prekursor mRNA pada mitokondria dan kloroplas (Gardner dkk, 1991). Pada proses autokatalitik ini tidak diperlukan sumber energi eksternal dan sumber protein (enzim). Sebaliknya, melibatkan serial transfer ikatan phosphoester. Menurut Yuwono (2008), mekanisme pemotongan intron secara autokatalitik dibedakan menjadi 2, yaitu gen-gen yang mengandung intron grup I dan intron grup II.

Pada intron grup I, proses splicing melibatkan penambahan nukleotida guanin pada ujung 5’ intron (Yuwono, 2008). Atau oleh Gardner dkk (1991), reaksi ini membutuhkan nukleosida guanin atau nukleotida dengan gugus 3’OH bebas (GTP, GDP, GMP atau guanosin) sebagai ko-faktor. Nukleotida guanin akan menyerang nukleotida adenin pada ujung 5’ intron dan melepaskan ekson 1. Gugus OH pada ekson 1 menyerang ekson 2 dan melepaskan intron yang linier (Yuwono, 2008)

Pada intron grup II penyerangan dilakukan oleh adenin yang ada dalam intron sehingga terbentuk struktur lariat. Mekanisme splicing intron grup II mempunyai kemiripan dengan mekanisme splicing menggunakan spliceosome (pemrosesan RNAd) (Klug & Summings, 1996). Hal ini memberikan gambaran adanya kemiripan fungsi antara snRNP (spliceosome) dengan gugus katalitik pada intron grup II. Dugaan lanjutan adalah intron pada mRNAS gen inti secara evolusioner berasal dari intron grup II yang ada pada bakteri.

Jadi, intron dipotong dengan transfer ikatan 2 phosphoester dan intron yang dipotong ini dilingkarkan menggunakan transfer ikatan phosphoester lainnya. Proses autokatalitik splicing ini terdapat intramolekuler secara alami, dan tidak bergantung pada konsentrasi. Lebih lanjut, prekursor RNA mampu membentuk pusat aktif dimana kofaktor guanosin 3’OH berikatan.

Proses pemotongan intron pada pre-mRNA

Pada prokariot, RNA hasil transkripsi langsung berfungsi sebagai molekul RNAd yang akan ditranslasikan pada biosintesis protein (Brown, 1989; Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Pada organisme prokariotik proses translasi berlangsung ketika transkripsi belum sepenuhnya selesai. Hal ini disebut sebagai coupled transcription and translation (Gardner dkk, 1991) atau transkripsi dan translasi berpasangan (Corebima, 2002). Menurut Gardner dkk (1991) hal ini terjadi karena tidak ada membran inti yang meisahkan transkripsi dan translasi dan arah transkripsi maupun arah translasi sama-sama 5’à 3’. Hal ini berbeda dengan mekanisme yang terjadi pada organisme eukariotik yang mengalami modifikasi terlebih dahul, berupa pemotongan intron, penambahan cap 5’ dan polyadenilasi 3’.

            Molekul RNAd pada prokariot maupun eukariot terdiri dari 3 bagian:

1.      urutan kepala 5’ (5’ leader sequence) : berisi informasi yang akan dibaca ribosom untuk mengarahkannya dengan tepat dalam memulai biosintesis protein

2.      urutan pengkode protein (protein-coding sequence): berisi informasi yang akan menentukan urutan asam amino pada biosintesis protein

3.      urutan ekor 3’ (3’ trailer sequence): tidak ditranslasikan menjadi asam amino

      (Corebima, 2002)

Pemotongan prekursor mRNA nuklear dilakukan dengan 2 tahap. Proses pemotongan ini dilakukan oleh struktur kompleks RNA/protein disebut spliceosome. Spliceosome mirip dengan ribosom kecil; mengandung set molekul RNA kecil yang disebut snRNA dan set protein yang masih belum diketahui dengan jelas srukturnya. Ada 5 jenis snRNA yang terlibat, yaitu U1,U2,U4, U5 dan U6 terlibat dalam splicing pre-mRNA sebagai komponen spliceosome (snRNA U3 dilokalisasi dalam nukleolus dan kemungkinan terlibat dalam pembentukan ribosom). snRNA tidak terdapat bagian molekul RNA bebas melainkan berada pada snRNP. Ada 4 bentuk snRNP. Masing-masing snRNP berisi masing-masing U1 U2 dan U5. Sedangkan snRNA U4 dan U6 berada pada 1 jenis partikel snRNP.

RNAd siap pakai pada eukariotik merupakan hasil dari modifikasi pasca transkripsi (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Modifikasi pasca transkripsi pada RNAd eukariotik meliputi:

1. penyingkiran hasil transkripsi intron (splicing)
2. modifikasi ujung RNAd hasil transkripsi (5’ capping dan penambahan ekor poly A)

Sedangkan menurut Gardner dkk (1991) proses modifikasi pasca transkripsi terhadap RNAd berlangsung meliputi tahapan:

1. pemotongan prekursor RNAd (pre RNAd) menjadi molekul RNAd yang lebih kecil
2. penambahan 7-methyl guanosine group (mRNA caps) pada ujung 5’
3. penambahan ±200 sekuen adenylate nucleotida (poly A) pada ujung 3’
4. pembentukan kompleks dengan protein tertentu

Proses penyingkiran hasil transkripsi diikuti dengan penyambungan hasil transkripsi ekson. Proses tersebut disebut sebagai RNAd splicing. Proses splicing meliputi tahapan:

1.  pemutusan sambungan di ujung 5’ intron:

Ujung 5’ hasil transkripsi intron mempunyai urutan nukleotida berbasa GU, sedangkan ujung 3’ memiliki urutan nukleotida berbasa AG. Menurut Gardner dkk (1991) urutan nukleotida tersebut merupakan nukleotida yang conserved (selalu sama letaknya): ekson-GU...intron...-AG-ekson. Menurut Russel (1992) dalam Corebima (2002) urutan tersebut spesifik untuk intron hasil transkripsi. Terjadi pemutusan sambungan di ujung 5’ intron.

2.  pelengkungan keluar urutan intron:

Ujung 5’ yang bebas selanjutnya melengkung dan berhubungan dengan suatu nukleotida berbasa A (yakni nukleotida yang merupakan bagian dari suatu urutan titik cabang atau branch point sequence). Nukleotida ini terletak pada hulu ujung 3’. Akibatnya terbentuk struktur lengkungan keluar yang oleh Russel (1992) disebut sebagai struktur lariat (lariat structure). Urutan konsensus titik cabang pada mamalia adalah YNCURAY (Y=pirimidin, R= purin, N= basa apapun). Nukleotida berbasa A terletak pada posisi urutan nukleotida ke 18 hingga 38 ke arah hulu ujung sambungan 3’. Sedangkan pada ragi, urutan pada titik cabang ini lebih rigid sekalipun posisinya lebih bervariasi, yaitu urutan UACUAAC. Posisi struktur lariat terjadi karena ikatan ujung 5’ dengan basa A (yang ditebalkan). Struktur lariat terjadi karena adanya ikatan fosfodiester 2’-5’yang tak lazim antara ujung 5’ dan basa A di titik cabang. Ikatan tersebut tepatnya terjadi antara gugus OH di karbon no.2 nukleotida berbasa A dengan gugus fosfat di atom karbon no. 5 dari nukleotida berbasa G (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002).   

3.  pemutusan hubungan hasil transkripsi di ujung 3’ intron dan penyambungan kedua ekson:

Pemutusan hubungan hasil transkripsi ini dilakukan dengan bantuan enzim nuklease. Setelah pemutusan ujung 3’, urutan intron dikeluarkan dari hasil urutan nukleotida pada RNAd. Hasil transkripsi intron yang tersingkir ini pada mulanya masih tetap bertahan dalam struktur lariat. Dengan bantuan debranching enzyme, struktur lariat diubah menjadi struktur linier dan didegradasi.

Gambar 6. Proses splicing pada sel ragi (sumber: http://8e.devbio.com/images/ch05/rna21p.GIF)

Proses penyingkiran hasil transkripsi intron berlangsung pada inti, yakni pada struktur yang disebut spliceosome. Spliceosome adalah struktur/kompleks penyambungan atau splicing complex. Spliceosome terdiri dari asosiasi beberapa RNPsn (small nuclear ribonucleoprotein particle) yang terikat pada RNAd prekursor. RNPsn sendiri merupakan asosiasi antara RNAsn (small nuclear RNA) dan protein. Terdapat 6 RNAsn dalam inti sel, yaitu U1-U6 yang berasosiasi dengan 6-10 macam protein membentuk RNPsn. U4 dan U6 berada pada RNPsn yang sama, sedangkan yang lainnya ditemukan pada RNPsn khusus sendiri-sendiri.

Model perakitan spliceosome dikemukakan oleh Russel (1992) dalam Corebima (2002) sebagai berikut:

1. RNPsn U1 berikatan dengan tapak penyambungan di ujung 5’ (terjadi akibat perpasangan basa RNPsn U1 dengan urutan tapak penyambungan di ujung 5’)
2. RNPsn U2 berikatan dengan daerah titik cabang
3. Partikel U4/U6/U5 yang belum dirakit bergabung dengan kompleks yang sedang terbentuk
4. RNPsn U4 berasosiasi dengan kompleks tadi, dan mengakibatkan terbentuknya spliceosome yang aktif.

Salah satu kemungkinan peranan spliceosome dalam penyingkiran intron adalah RNPsn membantu pelipatan RNAd prekursor menjadi struktur tertentu yang mengakibatkan RNAd prekursor dapat mengkatalisasi penyambungan sendiri. 

4. penggabungan hasil-hasil transkripsi ekson

5’ Capping

            Proses ini sebenarnya adalah penambahan nukleotida berbasa guanin (umumnya 7-methyl guanosine) pada nukleotida di ujung 5’ (Brown, 1989; Russel, 1992 dalam Corebima , 2002). Penambahan tersebut terjadi melalui ikatan tak lazim antara 5’ dan 5’. Terjadi pula proses penambahan 2 gugus CH3 pada dua nukleotida pertama dari rantai RNA.

            Tahapan proses 5’ capping adalah sebagai berikut:

1. Enzim polimerase II memulai transkripsi pada nukleotida yang memiliki basa tempat penambahan cap (tapak penutup atau cap site)
2. Bila hasil transkripsi mula-mula sepanjang 20-30 nukleotida, suatu struktur penutup (yang telah mengalami metilasi) ditambahkan pada ujung 5’ hasil transkripsi tersebut.
3. Penutup (cap) merupakan tempat ujung 5’ RNAd tempat berikatan dengan ribosom

Yuwono (2008) menerangkan proses metilasi yang terjadi sebagai berikut:

1. Enzim trifosfatase memotong gugus fosfat pada ujung pre RNAd
2. Enzim guanilil transferase menambahkan GMP (guanosin mono pospat).
3. Enzim metil transferase melakukan metilasi tudung guanosin pada N7 dan gugus 2’-O-metil pada nukleotida ujung tudung tersebut

Gambar 7. Pola 5’ capping

Tudung mRNA memiliki 4 fungsi yaitu:

1. melindungi mRNA dari degradasi
2. meningkatkan efisiensi translasi mRNA
3. meningkatkan pengangkutan mRNA dari nukleus ke sitoplasma
4. meningkatkan efisiensi proses splicing mRNA

(Yuwono, 2008)

Penambahan Ekor Poly A

            Pada ujung 3’ RNAd eukariotik terjadi penambahan urutan nukleotida yang berjumlah 50-250 nukleotida berbasa adenin (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Struktur ini dikenal sebagai ekor poly A. Penambahan ekor poly A ini terjadi pada RNAd semua spesies, kecuali pada RNAd protein kistron pada mamalia.

            Penambahan ekor poly A merupakan mekanisme yang pemberian sinyal yang menandakan ujung akhir dari RNAd eukariotik (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Pada eukariot, tidak ditemukan nukleotida terminasi transkripsi spesifik (seperti protein ρ pada prokariotik), sehingga proses transkripsi akan berlangsungn terus hingga mencapai ratusan bahkan ribuan nukleotida melalui tapak penambahan poly A. Pada suatu saat tertentu terjadi pemutusan pada tapak tersebut (dengan bantuan enzim endonuklease khas RNA) sehingga dihasilkan ujung 3’OH dan selanjutnya pada ujung itu ditambahkan ekor poly A.

            Pada posisi 10-30 nukleotida di hulu tapak poly A terdapat urutan AAUAAA yang bertanggungjawab menandai lokasi tapak poly A, selain urutan nukleotida lain di hilir tapak poly A yang juga ikut berperan (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Penambahan ekor poly A dikatalisasi oleh enzim polymerase poly (A)

            Peranan ekor poly (A) berhubungan dengan stabilitas RNAd (Russel, 1992 dlam Corebima, 2002). Hal ini diketahui dari percobaan RNAd protein globin yang masih memiliki ekor poly A normal, disuntikkan dalam oosit katak, akan tetap aktif ditranskripsikan selam ajangka waktu yang cukup lama, sedangkan jika yang disuntikkan tanpa ekor poly (A), maka RNAd tersebut akan didegradasi.

TRANSLASI

Translasi

            Proses translasi lebih kompleks daripada replikasi dan transkripsi. Translasi melibatkan 4 hal, yaitu mRNA, tRNA, ribosom, dan asam amino. mRNA adalah kode yang akan diterjemahkan. tRNA adalah penterjemah mRNA. Ribosom adalah tempat terjadingan penerjemahan. Asam amino adalah hasil terjemahan kode mRNA oleh tRNA. Ribosom terdiri atas 2 subunit, yaitu subunit besar dan subunit kecil. Ke-2 subunit bergabung jika terjadi translasi.

Translasi mRNA oleh ribosom dapat terjadi sebelum transkripsi selesai dan translasi dapat dilakukan oleh banyak robosom (poliribosom). Mekanisme demikian memungkinkan pertumbuhan dan respons bakteri yang luar biasa cepat. Translasi dimulai dari masuknya mRNA ke dalam ribosom (subunit kecil). Urutan translasi adalah sebagai berikut. mRNA terikat pada subunit kecil ribosom. Dengan terikatnya mRNA, maka subunit besar berasosiasi dengan subunit kecil menghasilkan ribosom utuh. Proses penterjemahan berlangsung dengan terjadinya proses penterjemahan mRNA oleh tRNA menjadi asam amino. Proses penterjemahan berhenti ketika tRNA mengenali kode berhenti pada mRNA.

Kode awal mRNA adalah AUG. Proses terjemahan mRNA berlangsung per 3 kode (triplet kodon). Terdapat 64 kode untuk 20 asam amino, sehingga terdapat lebih dari 1kode untuk 1 asam amino (Tabel 8.1). Dengan demikian terdapat 64 tRNA berasosiasi dengan 20 asam amino. 

Tabel. Triplet kodon asam amino pada mRNA

Kode pertama	Kode kedua				Kode ketiga
	U	C	A	G
U	Fenilalanin Fenilalanin Leusin Leusin	Serin Serin Serin Serin	Tirosin Tirosin Stop Stop	Sistein Sistein Stop Triptofan	U C A G
C	Leusin Leusin Leusin Leusin	Prolin Prolin Prolin Prolin	Histidin Histidin Glutamin Glutamin	Arginin Arginin Arginin Arginin	U C A G
A	Ileusin Ileusin Ileusin Metionin	Treonin Treonin Treonin Treonin	Asparagin Asparagin Lisin Lisin	Serin Serin Arginin Arginin	U C A G
G	Valin Valin Valin Valin	Alanin Alanin Alanin Alanin	Aspartat Aspartat Glutamat Glutamat	Glisin Glisin Glisin Glisin	U C A G

http://cahscient.files.wordpress.com/2008/08/textbook-mikrobiologi8.doc

Tranlasi RNA menjadi protein atau polipeptida

Translasi  adalah proses penerjemahan kode-kode genetic (kodon) yang ada pada molekul mRNA urutan-urutan asam amino. Hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Pembacaan dari sebuah molekul mRNA mulai dari sebuah titik permulaan yang tepat. Codon pertama yang dibaca adalah AUG, yang memberi tanda asam amino methionine. Dalam sel-sel bakterial, codon AUG memberi tanda methionine (Met) ketika muncul di mana pun dalam molekul mRNA. Pada beberapa  bakteria, codon AUG bertindak sebagai inisiator codon yang mengkhususkan f-Met untuk memulai rantai polypeptide, meskipun ketika GUC muncul pada posis  internal dalam molekul mRNA, memberi kode untuk valine. Baik itu Met atau f-Met merupakan bagian pertama dari asam amino dalam semua rantai peptide ketika mereka disintesiskan secara inisial, terminal asam amino bisa dimodifikasi secara enzimatis kemudian. Deformylase bisa memindahkan grup formyl dari formylmethionine, dan methionine amino peptidase bisa memindahkan methionine dari amino  terminus dari peptide. Olehkarena itu, tidak semua polypeptides dalam mikroorganisme memiliki f-Met pada ujung terminal amino mereka.

Bagian pangkal codon menentukan ‘reading frame’ (rentetan tiga-nucleotide) untuk bagian selebihnya dari molekul mRNA , sebab, landasan-landasan nucleotide dibaca tiga pada satu waktu sepanjang rentai berkelanjutan dari nucleotides, mengubah posisi kerangka membaca dengan memasukan atau menghapus landasan nucleotide tunggal dalam sebuah gen bisa mempengaruhi secara dramatis rentetan asam amino dari protein yang bisa diproduksinya.

Karena terjemahan bisa dimulai secara teoritis dengan berbagai nucleotide melalui triplet codons, terdapat tiga kerangka membaca potensial dalam berbagai kawasan di DNA. Sebuah protein diterjemahkan dengan kerangka yang mulai dengan codon inisiasi AUG, memperluas melalui satu seri codon-codon yang mengkhususkan asam amino, dan berakhir ketika terminasi codon dicapai.

Sebuah kerangka membaca yang mengandung codon-codon yang secara eksklusif mengkode asam amino disebut ‘open reading frame’ (ORF). Kerangka membaca yang terkunci tidak bisa dibaca menjadi protein karena kehadiran terminasi codon-codon. Deteksi dari sebuah ORF, yang bisa dilakukan dengan menguji rentetan nucleotide diterjemahkan menjadi sebuah protein. Melacak database dari rentetan nucleotide yang telah ditunjuk untuk memberi kode protein-protein yang dikenali bisa membantu mengidentifikasi fungsi dari  kerangka membaca terbuka. Homologies tinggi ditemukan sepanjang spesies-spesies untuk rentetan nucleotides yang telah melibatkan dan mengode protein-protein dengan fungsi-fungsi identik.

Beberapa protein dibutuhkan sebagai faktor-faktor inisiasi untuk memulai proses terjemahan. Dalam sel-sel bakterial, tiga faktor inisiasi, IF1, IF2 dan IF3 dibutuhkan. Sedikit informasi yang diketahui mengenai faktor-faktor inisiasi eukaryotik 4D (eIF4D). Dalam sel-sel eukaryotik, paling tidak sembilan faktor-faktor inisiasi eukaryotik (eIF1 ke eIF6) dibutuhkan untuk memulai sintesis protein.

Translasi berlansung di dalam ribosom. Pada organisme prokaryot, translasi sudah dimulai sebelum transkripsi (sintesis mRNA) selesai dilakukan. Dengan demikian proses transkripsi dan translasi pada prokaryot berlangsung secara hampir serentak. Sebaliknya pada eukaryot, proses translasi baru dapat berlangsung jika proses transkripsi (sintesis mRNA yang  matang) sudah selesai dilakukan. Dalam proses translasi diperlukan molekul  tRNA yang berfungsi membawa asam amino spesifik. Terdapat 1 sampai 6 t-RNA untuk masing-masing asam amino dari 20 asam amino yang dikenal pembentuk protein. Ribosom mengkatalisis pembentukan ikatan peptida di antara dua asam amino yang berdekatan.Terdapat sekitar 20 macam tRNA yang masing-masing membawa asam amino spesifik, karena di alam terdapat 20 asam amino yang menyusun protein alami.

Sintesis protein terdiri atas 3 tahap, inisiasi, elongasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi, dibentuklah kompleks inisiasi untuk kemudian memulai sintesis dan berikatan dengan start kodon pada mRNA . Suatu bagian dari rantai mRNA yang menjadi tempat mulainya translasi adalah Ribosome Binding Sites (RBS) atau sekuen Shine Dalgarno. Proses translasi dimulai dari menempelnya ribosom pada RBS. Setelah subunit 30S dari ribosom menempel pada RBS. Subunit itu bergerak sepanjang mRNA hingga mencapai kodon awal (kodon AUG). Selama elongasi asam amino membentuk ikatan kovalen secara  berurutan mengikuti gerakan ribosom sepanjang mRNA. Terminasi sintesis potein terjadi jika ribosom sampai kepada kodon nonsens (UAA, UGA, UAG). Peptida selanjutnya terlepas dari ikatan tRNA dan ribosom berdisosiasi menjadi sub unitnya. Translasi adalah penerjemahan kodon pada mRNA menjadi suatu polipetida.

Kode genetika adalah triplet, karena masing-masing kode terbentuk dari tiga nukleotida yang disebut kodon. Kodon terdiri dari tiga dari empat kemungkinan nukleotida (A, U, C dan G). Ini berarti akan terdapat 43 = 64 kodon. Keenam puluh empat kodon ini dikenal oleh t RNA kecuali tiga yang disebut kodon nonsens.

Sjahril, Rinaldi. 2008. Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer Genetik Tanaman. Jurusan Budidaya Tanaman, Fakultas Prtanian, Unhas. Makassar.

TRANSLASI/ BIOSINTESIS PROTEIN

Protein merupakan produk dari aliran informasi genetik. Sel membutuhkan ribuan protein yang berbeda setiap waktu. Protein-protein ini harus di sintesis, dibawa ke tempatnya berfungsi dan didegradasi bila tidak diperlukan lagi. Sintesis protein eukariot melibatkan 70 jenis protein ribosom, 20 jenis enzim untuk mengaktifkan prekursor asam amino, 20 atau lebih enzim dan faktor protein  lain untuk inisiasi, elongasi dan terminasi polipeptida; mungkin 100 enzim untuk pemrosesan protein; dan 40 atau lebih transfer dan ribosomal RNA. Secara keseluruhan, hampir sekitar 300 makromulekul yang berbeda terlibat pada sintesis polipeptida. Namun protein di sintesis dengan kecepatan yang tinggi. Polipeptida dengan 100 residu asam amino dalam E. coli (pada 37 oC), disintesis dalam waktu sekitar 5 detik. Sintesis ribuan protein yang berbeda di dalam sel di regulasi dengan ketat, sehingga protein hanya di sintesis sesuai dengan kebutuhan metabolik sel.

1. Kode Genetik

Ketika menemukan struktur DNA, Francis Crick sudah mempertimbangkan bagaimana informasi genetik yang dikode dalam empat huruf pada DNA dapat di translasi menjadi 20 huruf pada protein. Crick beralasan bahwa asam nukleat yang berukuran kecil (mungkin RNA) dapat berperan sebagai ‘adaptor’. Salah satu bagian dari adaptor berikatan dengan asam amino tertentu dan bagian lain mengenali urutan nukleotida yang dikode oleh asam amino pada mRNA. Ide ini kemudian diverifikasi dengan ditemukannya tRNA. tRNA merupakan molekul adaptor yang berfungsi menterjemahkan urutan nukleotida dalam mRNA menjadi urutan asam amino dalam polipeptida. Keseluruhan proses sintesis protein yang dipandu oleh mRNA ini disebut proses translasi.

Setiap deretan tiga basa pada mRNA, mengkode satu asam amino spesifik disebut kodon. Terdapat empat basa pada nukleotida (A, G, C dan T) sehingga terdapat 43 = 64 kodon. Beberapa kodon mempunyai fungsi khusus. AUG merupakan kodon inisiasi yang merupakan awal suatu polipeptida, di samping AUG juga mengkode metionin dalam polipeptida. Kodon UAA, UAG dan UGA tidak mengkode asam amino dan merupakan kodon terminasi atau disebut juga stop kodon. Translasi terjadi dengan cara, setiap kodon dibaca berurutan dan tidak overlap (tumpang tindih). Kodon pertama pada gen menyediakan reading frame (pola pembacaan).  Reading frame tanpa stop kodon sebelum 50 kodon disebut open reading frame dan biasanya merupakan suatu gen.

Gambar. Kode Genetik

2. Transfer RNA (tRNA)

Seperti sudah dijelaskan di atas, proses translasi memerlukan molekul tRNA. tRNA merupakan molekul adaptor yang berfungsi menterjemahkan urutan nukleotida dalam mRNA menjadi urutan asam amino  dalam polipeptida. Pada tRNA terdapat urutan tiga basa yang disebut antikodon. Antikodon ini komplemen dengan salah satu kodon. Sedangkan pada ujung 3’ tRNA terikat asam amino spesifik. tRNA yang sudah mengikat asam amino disebut aminoasil tRNA. Paling kurang terdapat 61 jenis tRNA di sitoplasma yang membawa asam amino yang berbeda. tRNA akan membawa asam amino dari sitoplasma ke ribosom, tempat dimana sintesis protein terjadi, dan antikodon akan mengenali kodon komplemennya.

Gambar. Struktur tRNA

3. Ribosom

Ribosom merupakan tempat sintesis protein. E. coli mengandung lebih dari 15.000 ribosom yang terdapat bebas di sitoplasma. Ribosom merupakan kompleks antara protein dan rRNA dan terdiri dari dua subunit, yaitu subunit besar dan subunit kecil. Pada bakteri subunit kecil mempunyai ukuran 30S dan subunit besar 50S, sementara pada eukariot subunit kecil 40S dan subunti besar 60S. Ribosom bakteri mengandung sekitar 65% rRNA dan 35% protein. Pada ribosom terdapat tiga situs untuk mengikat aminoasil tRNA yaitu: situs aminoasil (A), situs peptidil (P) dan situs exit (E).

Gambar. Ribosom bakteri dan eukariot

4. Mekanisme translasi

Proses translasi berlangsung pada ribosom dan merupakan proses sintesis protein berdasarkan informasi yang berada pada mRNA. mRNA yang ditranslasi harus terikat pada ribosom dan pada organisme prokariot pada ujung 5’nya terdapat suatu urutan yang mengenali ribosom. Urutan ini  dikenal sebagai situs pengikatan ribosom atau ribosome binding site (RBS). Proses translasi terdiri atas tiga sub proses, yaitu inisiasi, elongasi dan terminasi.

5. Translasi pada prokariot

Komponen pada tahap inisiasi organisme prokariot meliputi kodon insiasi (AUG), tiga faktor insiasi (IF1, IF2 dan IF3), tRNA inisiator (fMet-tRNA), ribosom subunit 30S dan 50S, dan GTP. Setelah diaktifasi oleh faktor inisiasi, tRNA inisiator yang membawa anti kodon CAU akan menempati situs P pada ribosom. tRNA kedua yang membawa anti kodon untuk kodon kedua memasuki situs A pada ribosom. Asam amino yang dibawa oleh tRNA kedua akan membentuk ikatan peptida dengan asam amino pertama. Setelah ikatan peptida terbentuk, tRNA yang membawa kedua asam amino akan bertranslokasi dari situs A ke situs P. Hal ini berlangsung terus menerus sampai mencapai stop kodon (UAG. UAA. UGA).

Gambar. Translasi pada prokariot. (a) Inisiasi, (b) Elongasi, (c) Translokasi.

Tidak ada antikodon yang mengenali kodon terminasi. Translasi berhenti dengan adanya protein yang disebut Release Factor (RF) yang mengenali kodon terminasi. Pada prokariot terdapat tiga faktor terminasi yaitu, RF1 yang mengenali kodon UAA dan UAG dan RF2 yang mengenali kodon UGA dan UAA, sementara RF3 belum diketahui fungsinya. Pengikatan RF ini memberikan sinyal bahwa proses translasi telah berhenti. Kedua subunit ribosom akan berdisosiasi dari mRNA dan polipeptida dibebaskan dari tRNAnya.

Gambar. Terminasi translasi pada prokariot.

6. Translasi pada eukariot

Inisiasi translasi pada organisme eukariot mirip dengan inisiasi pada organisme prokariot tetapi urutannya berbeda dan melibatkan faktor inisiasi yang lebih banyak. Perbedaan tersebut disebabkan oleh karena perbedaan struktur ribosom dan kedua organisme. Faktor inisiasi translasi untuk organisme eukariot dinamai eIFs (eukaryote Initiation Factor). Komponen pada tahap inisiasi organisme eukariot adalah kodon inisiasi (AUG), lima faktor inisiasi (eIFl, eIF2, eIF3, eIF4, eIF5), tRNA inisiator (met-tRNA), ribosom subunit 40S dan 60S, GTP dan ATP. Pada eukariot tRNA inisiator aminoasil-tRNA, GTP dan eIF2 membentuk kompleks terlebih dahulu sebelum berikatan dengan subunit 40S. Setelah kompleks inisiasi terbentuk proses translasi dilanjutkan dengan pemanjangan rantai polipeptida (tahap elongasi). Mekanisme elongasi pada organisme eukariot mirip dengan mekanisme elongasi pada organisme prokariot. Tahap awal elongasi adalah pengikatan aminoasil-tRNA pada situs A melalui penggabungan dengan kodon kedua mRNA. Aminoasil-tRNA memasuki ribosom dengan bantuan faktor elongasi eEF-1 membentuk kompleks dengan GTP. Faktor elongasi merupakan protein yang berasosiasi terus menerus dengan ribosom selama penambahan asam amino pada rantai polipeptida.

Pemanjangan rantai polipeptida berlangsung terus menerus sampai mencapai kodon yang tidak dikenali oleh anti kodon yang dibawa oleh tRNA. Sel prokariot dan sel eukariot juga tidak memiliki tRNA dengan antikodon yang komplemen dengan sinyal terminasi, tetapi memiliki faktor terminasi (release factor, RF) yang mengenali sinyal terminasi sintesis protein. Pada organisme eukariot hanya terdapat satu faktor terminasi yaitu RF yang mengenali ketiga kodon stop UAG, UAA dan UGA. RF berikatan dengan kodon terminasi pada situs A ribosom dan menstimulasi hidrolisis ikatan tRNA dan rantai polipeptida pads situs P yang menyebabkan rantai polipeptida lepas dari ribosom, tRNA dilepaskan  serta subunit ribosom dan templat mRNA berdisosiasi.

Pada bakteri, proses transkripsi dan translasi bisa terjadi bersamaan, karena DNA berada di sitoplasma dan semua proses replikasi, transkripsi dan translasi terjadi di sitoplasma. Bahkan mRNA yang belum selesai di transkripsi sudah mulai di translasi. Tapi pada eukariot keadaannya berbeda, karena replikasi dan transkripsi terjadi di dalam inti. mRNA kemudian di bawa ke sitoplasma untuk di translasi.

Tahap akhir dari sintesis  protein adalah pelipatan dan pemrosesan. Polipeptida hasil translasi memerlukan struktur yang  tepat untuk berfungsinya. Proses pelipatan protein meliputi pembentukan ikatan hidrogen, interaksi van der Waals, ikatan ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan disulfida. Sehingga polipeptida hasil translasi yang awalnya satu dimensi membentuk struktur tiga dimensi. Selain itu beberapa protein prokariot dan eukariot juga mengalami modifikasi pasca translasi, seperti: pemotongan peptida sinyal, glikosilasi, fosforilasi, asetilasi dan metilasi.

Gaffar, Shabarni. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Jurusan Kimia, FMIPA Unpad. Bandung

REGULASI GEN PADA PROKARIOTIK

 A.    Pengertian Operon

Di dalam sel prokaryot, terdapat beberapa gen struktural yang diekspresikan secara bersama-sama dengan menggunakan suatu promotor yang sama. Kelompok gen semacam ini disebut sebagai “operon”. Misalnya metabolisme laktosa, arabinosa, dan lain-lain. Pada prokaryot, secara umum dikenal dua macam sistem pengendalian ekspresi genetik yaitu pengendalian positif dan pengendalian negatif. Pengendalian (regulasi) pada suatu gen atau operon melibatkan aktivitas suatu gen regulator (Yuwono,2005)

Gen pada sebuah operon diekspresikan secara terkoordinasi. Gen tersebut dapat diaktifkan atau dinonaktifkan. Apabila terjadi ekspresi operon, semua gen yang terdapat di dalamnya mengalami transkripsi. Dalam hal ini terbentuk mRNA polisistronik yang mengkode semua protein operon. mRNA polisistronik ini mengandung banyak rangkaian kodon start dan kodon stop yang memungkinkan pembentukan sejumlah protein dari sebuah transkrip pada tingkat translasi.

Gen untuk protein yang dihasilkan oleh suatu operon disebut gen struktural. Transkripsi gen struktural diatur oleh promotor yang terletak di ujung 5’ operon ke arah hulu dari gen untuk protein. Banyak mekanisme untuk pengaturan sintesis protein yang mempengaruhi pengikatan RNA polimerase ke promotor dan dengan demikian bekerja pada tingkat inisiasi transkripsi. Sebagian protein pengatur berikatan dengan promotor dan merangsang/menghambat pengikatan RNA polimerase. Pada kontrol positif, protein pengatur merangsang transkripsi. Pada kontrol negatif, protein pengatur menghambat transkripsi.

            Transkripsi operon juga dikendalikan oleh faktor sigma (σ) yang berikatan dengan RNA polimerase yang menyebabkan faktor tersebut mengenali dan lebih mudah berikatan dengan promotor tertentu. Mekanisme lain melemahkan transkripsi RNA yang sedang berlangsung. Banyak mekanisme pengatur ini mungkin saling tumpang tindih, bekerja pada operon tunggal untuk memungkinkan berespon dengan cepat terhadap perubahan kondisi.  

 

                        Gambar 1 Regulasi Operon oleh Represor

                        Gambar 2 Cara Kerja Inducer

B.     Regulasi Pada prokariot

Regulasi ekspresi gen banyak dimengerti melalui mekanisme yang dipelajari pada bakteri. Sistem regulasi yang pertama dimengerti ialah system regulasi operan laktosa pada bakteri E. coli oleh Yacob Manot. Regulasi ini berperan dalam mengatur produk si enzim β-galaktosidase, ketika bakteri harus memilih menggunakan laktosa atau glukosa sebagai sumber karbonnya. Dua sistem regulasi yang paling umum yang paling umum dilakukan pada bakteri, yaitu system operan laktosa (operan lac) dan system operan triptopan (operan trp).

Pada operan lac ekspresi gen diatur pada tingkat promoter dengan enzim transkriptase (pengendali transkripsi). Pada operan trp ekspresi diatur dengan cara menghentikan transkripsi bila produk transkripsi, yaitu tryptophan sudah mencapai kuantitas yang dibutuhkan.

Gambar 3 Model Operon

C.    Pengendalian negatif operon laktosa (lac)

System operon lac adalah system pengendalian ekspresi gen-gen yang bertanggung jawab di dalam metabolisme laktosa.

Jika bakteri E.coli yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung sumber karbon glukosa dan laktosa secara bersama-sama, maka E.coli akan menumbuhkan pola pertumbuhan yang spesifik. Setelah melalui fase adaptasi, E.coli memasuki fase eksponensial yang ditandai dengan laju pertumbuhan yang meningkat secara eksponensial kemudian akan mencapai fase stasioner. Setelah mencapai fase stasioner  beberapa saat kemudian bakteri akan tumbuh lagi memasuki fase eksponensial kedua sampai akhirnya mencapai fase stasioner akhir. Dalam fase pertumbuhan semacam ini ada dua fase eksponensial. Pada fase eksponensial pertama E.coli menggunakan glukosa sebagai sumber karbon sampai akhirnya glukosa habis dan E.coli mencapai fase stasioner pertama. Selanjutnya pada fase eksponensial kedua, E. coli menggunakan laktosa setelah glukosa benar-benar habis, pada saat inilah sebenarnya mulai terjadi proses induksi sistem operon laktosa yang akan digunakan untuk melakukan metabolisme laktosa, ini disebut pola pertumbuhan diauksik (diauxic) artinya bantuan, karena kedua macam gula tersebut membantu bakteri untuk tumbuh.

Pada fase stasioner pertama, operon lactisa terdiri atas beberapa gen mulai diaktifkan. Operon laktosa terdiri atas 3 gen struktural utama yaitu gen lacZ (mengkode enzim β galactosidase), gen lacY (mengkode permease galactosida), dan gen lacA (transasetilase thiogalaktosida). Ketiga gen structural yang berbeda tersebut dikendalikan ekspresinya oleh satu promoter yang sama dan menghasilkan satu mRNA yang bersifat polisistronik (polycistronic) karena dalam satu transkrip terdapat lebih dari satu cistron (sinonim dari kata gen). Masing-masing cistron tersebut ditranslasi menjadi tiga polipeptida yang berbeda tetapi semuanya terlibat di dalam metabolisme laktosa. Selain ketiga gen structural tersebut, juga terdapat gen regulator lacl yang mengkode suatu protein repressor (tersusun atas 3.60 asam amino) dan merupakan bagian system  pengendalian operon lactose. Operon lactose dapat dikendalikan secara negative maupun secara positif.

Enzim β galactosidase adalah enzim utama yang digunakan untuk memotong ikatan β galactosidik yang ada pada molekul lactose sehingga dihasilkan dua monosakarida, yaitu glukosa dan galaktosa. Enzim permease galaktosida adalah enzim yang berperanan dalam pengangkutan lactose dari luar ke dalam sel. Enzim yang ketiga yaitu, transasetilase thiogalaktosida, sampai sekarang belum diketahui secara jelas peranannya di dalam metabolisme lactose.

Pengendalian operon laktosa secara negatif dilakukan oleh protein represor yang dikode oleh gen lacl. Repressor lacl adalah suatu protein tetramerik yang tersusun atas empat polipeptida yang identik. Represor ini menempel pada daerah operator (lacO) yang terletak disebelah hilir dari promotor. Operon lac berukuran sekitar 28 pasangan basa. Penempelan represor semacam ini menyebabkan RNA polimerase tidak dapat melakukan transkripsi gen-gen struktural lacZ, lacY, dan lacA sehingga operon laktosa dikatakan mengalami represi. Proses penekanan atau represi semacam ini terjadi terus menerus selama tidak ada laktosa di dalam sel. Inilah yang disebut mekanisme efisiensi seluler karena sel tidak perlu mengaktifkan operon lactose jika memang tidak ada lactose sehingga energy seluler dapat dihemat. Sel akan cenderung untuk menggunakan sumber karbon yang lebih sederhana terlebih dahulu, misalnya glukosa, untuk memenuhi kebutuhan selularnya. Setelah tidak ada lagi glukosa di dalam sel, maka sel akan mencari alternatife sumber karbon yang tersedia. Jika sel E.coli ditumbuhkan dalam medium yang mengandung glukosa dan lactose, maka setelah glukosa benar-benar habis sel akan melakukan metabolism lactose yang ada dengan cara mengaktifkan terlebih dahulu system operon lactose. lactose Proses pengaktifan operon lactose semacam ini disebut sebagai proses induksi.

Induksi operon lactosa dapat terjadi jika ada lactosa di dalam sel. Lactosa yang ada di dalam medium pertumbuhan sel diangkut ke dalam sel dengan menggunakan enzim permease galaktosida. Operon lactose sebenarnya tidak sepenuhnya ketat karena di dalam sel selalu ada produk ekspresi operon ini meskipun pada aras paling dasar. Oleh karena itu, meskipun belum ada induksi sepenuhnya di dalam sel sudah ada produk enzim permease galaktosida. Enzim inilah yang akan mengangkut laktosa ke dalam sel. Demikian pula halnya dengan enzim β galactosidase di dalam sel yang selalu ada dalam jumlah terbatas, meskipun belum ada induksi sepenuhnya, sehingga dapat mengubah lactose menjadi allolactosa. Laktosa adaalh disakarida glukosa/galaktosa yang terikat melalui ikatan β-1,4, sedangkan alloklactosa mempunyai ikatan β-1,6. Allolaktosa ini yang sesungguhnya menjadi inducer untuk mengaktifkan operon lactose Yuwono , 2005).

Gambar 4. Sistem induksi dan represi pada prokariot (a) Regulasi negative pada system ekspresi gen prokariot. (sumber Yuwono:, 2005)

Selama tidak ada proses induksi, molekul reseptor yang di kode oleh lacl akan selalu menempel pada operon lac. Meskipun demikian, RNA polymerase tetap dapat menempel pada promotor lac, hanya saja tidak dapat melakukan transkripsi karena terhambat oleh molekul repressor yang menempel pada daerah operon. Repressor yang dikode oleh lacl merupakan molekul protein allosterik yang mempunyai sisi pengikatan yang berbeda untuk DNA dan molekul induser. Protein allosterik (allos [latin] artinya lain, sedangkan sterik berasal dari kata stereo yang berarti bentuk) adalah protein yang mempunyai dua sisi pengikatan dengan molekul lain. Jika protein terebut berikatan dengan suatu molekul, maka hal ini akan mengubah bentuk protein pada sisi yang lain sehingga mengubah interaksinya dengan molekul kedua. Molekul induser dapat terikat pada repressor yang berada dalam keadaan bebas di dalam sel maupun pada saat repressor terikat pada DNA. Dengan adanya induser (laktosa yang diubah menjadi alolaktosa) maka molekul induser akan menempel pada repressor. Penempelan tersebut akhirnya mengubah secara allosterik konformasi molekul repressor sehingga repressor tidak dapat menempel lagi pada operator. Oleh karena itu, daerah operator berada dalam keadaan bebas sehingga dapat dilewati oleh RNA polymerase untuk melakukan transkripsi gen lacZ, lacY, dan lacA. Setelah ditranskripsi, tarnskripsi yang membawa kodon-kodon untuk ketiga macam enzim tersebut selanjutnya di translasi menghasilkan enzim  b-galaktosidase dan permase galaktosida dan transasetilase thiogalaktosida. Enzim  b-galaktosidase dan permase galaktosida itulah yang akhirnya digunakan untuk metabolisme laktosa.

D.    Pengendalian positif operon laktosa (lac)

Selain dikendalikan secara negatif, operon lac juga dikendalikan secara positif. Dalam sistem semacam ini operon lac diaktifkan kembali setelah sebelumnya ditekan sampai aras paling dasar (basal level). Pengendalian positif memberikan keuntungan bagi sel karena operon laktosa tetap dalam keadaan nonaktif selama masih tersedia glukosa dalam jumlah banyak. Dalam kasus operon lac, penghilangan represor dari operator tidak cukup untuk mengaktifkan operon tersebut sehingga diperlukan suatu sistem yang bekreja secara positif (mempercepat) proses pengaktifan operon. Pada saat E. coli ditumbuhkan dalam medium yang mengandung dua macam sumber karbon yang berbeda, yaitu glukosa dan laktosa, maka sel tidak perlu mengaktifkan operon laktosa jika di dalam sel masih tersedia glukosa. Hal ini ditunjukkan dalam suatu eksperimen menggunakan E. coli yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung suksinat dan IPTG (isopropil thigaluktosida). IPTG mempunyai struktur yang mirip dengan laktosa sehingga dapat berfungsi sebagai inducer operon laktosa. Pada saat awal ketika IPTG tersedia, b-galaktosidase dapat diekspresikan. Akan tetapi ketika ditambahkan glukosa maka sintesis enzim ini mengalami penurunan yang tajam. Pada awalnya diduga bahwa suatu katabolic glukosa (produk pemecahan glukosa) menjadi penyebab fenomena ini sehingga kemudian dikenal sebagai fenomena represi katabolic atau efek glukosa. Akan tetapi, ketika molekul nukleotida cAMP (cyclic AMP) ditambahkan bersama-sama dengan glukosa, proses represi sintesis b-galaktosidase tidak terjadi. Represi katabolic semacam ini juga terjadi operon yang lain.

Represi katabolik pada operon lac dilakukan melalui protein regulator yang dikenal sebagai CAP (catabolic activator protein) dan suatu molekul efektor
yaitu cAMP. Telah diketahui bahwa E. coli konsentrasi cAMP yang disintesisi
oleh enzim adenil siklase, berkebalikan dengan konsentrasi glukosa dalam sel. Hal
itu berarti bahwa jika konsentrasi glukosa rendah, maka konsentrasi cAMP
meningkat. Pada saat konsentrasi cAMP meningkat, yaitu pada saat konsentrasi
glukosa rendah, cAMP akan berikatan dengan CAP dun mengaktifkan operon lac.

Promotor lac mempunyai dua sisi pengikatan yang berbeda, yaitu sisi
pengikatan untuk RNA polimerase dan sisi pengikatan untuk kompleks CAP‑
cAMP. Kompleks CAP-cAMP terikat pada promotor lac pada daerah diantara
sekuens -72 dan -52 dihitung dari nukleotida pertama operon lac. Sekuens
konsensus sisi pengikatan CAP-cAMP adalah TGTGA. Sisi pengikatan kompleks
CAP-cAMF semacam ini bervariasi dari satu operon dengan operon yang lain,
misalnya pada operon gal sisi pengikatan tersebut terletak pada sekuens -50 dan ‑
23, sedangkan pada operon ara terletak pada daerah -170 dan -78. Meskipun mekanisme rinci pengaktifan operon lac belum diketahui secara jelas, diduga
protein CAP mampu melakukan perubahan pada struktur DNA atau berinteraksi
secara langsung dengan RNA polimerase. Bukti-bukti menunjukkan bahwa
pengikatan kompleks CAP-cAMP pada promotor membantu RNA polimerase
untuk terikat pada Promotor. Salah satu hipotesis mengatakan bahwa kompleks
CAP-cAMP dan RNA polimerase saling bersentuhan karena keduanya melekat
pada sisi yang berdekatan di promotor. Kedekatan ikatan CAP-cAMP dengan
RNA polimerase tersebut menyebabkan ikatan RNA polimerase dengan promotor
menjadi lebih kuat. Pada kasus operon lac, sisi pengikatan CAP-cAMP dengan RNA polimerase tersebut menyebabkan ikatan RNA polimerase dengan promotor menjadi lebih kuat. Pada kasus operon lac, sisi pengikatan CAP-cAMP dengan RNA polimerase memang secara fisik berdekatan, tetapi pada operan ara sisi pengikatan activator teresbut berada cukup jauh dari promotor. Hipotesis mengatakan bahwa CAP-cAMP mampu menyebabkan perubahan pada struktur DNA yaitu dengan mendekatkan hubungan antara kompleks CAP-cAMP dengan RNA polimerase.

Jadi secara umum dapat dijelaskan bahwa pengikatan CAP-cAMP pada promotor menyebabkan RNA polimerase dapat tertarik pada promotor membentuk kompleks promotor tertutup (close promotor complex) yang selanjutnya akan menjadi kompleks promotor terbuka yang siap melakukan ripsi. Pengikatan RNA polimerase pada promotor tersebut difasilitasi oleh CAP-cAMP melalui interaksi protein-protein, pembengkokkan DNA atau kedua-nya.

Gambar 5. Sistem induksi dan represi pada prokariot (b) Regulasi positif pada sistem ekspresi gen prokariot. (Sumber : Yuwono, 2005)

E.     Pengendalian operon triptofan (trp)

Operon trp berperanan di dalam sintesis asam amino triptofan pada E. coli. Operon trp, dikendalikan melalui dua macam mekanisme yaitu : (1) penekanan (represi) oleh produk akhir ekspresi, dan (2) pelemahan (attenuation). Operon ini dikenal secara negatif oleh suatu represor seperti pada operon lac. Meskipun demikian, ada perbedaan fundamental antara kedua operon tersebut. Operon lac adalah operon yang mengkode enzim-enzim katabolik, yaitu enzim yang digunakan untuk merombak suatu senyawa, sedangkan operon trp adalah operon yang mengkode enzim-enzim anabolik yang digunakan untuk sintesis suatu senyawa. Operon untuk enzim katabolik cenderung akan diaktifkan jika ada senyawa yang akan dirombak, misalnya laktosa. Sebaliknya, operon untuk enzim anabolic pada umumnya akan dinonaktifkan jika tersedia senyawa yang akan disintesis, misalnya triptofan, maka operon trp akan dinonaktifkan. Selain dengan mekanisme pengendalian negatif semacam ini, operon trp juga mempunyai mekanisme pengendalian lain, yaitu mekanisme pelemahan yang tidak ada pada operon lac.

Pengendalian negatif operon trp dilakukan dengan cara menekan ekspresi
gen-gen dalam operon itu pada saat tersedia triptofan dalam jumlah banyak. Operon trip terdiri atas 5 gen struktural, yaitu tripE, D, C, B dan A. Promotor dan operator operon ini terletak pada daerah yang sama. Hal ini berbeda dengan operator lac yang terletak tepat pada sisi sebelah hilir promotor lac. Pada daerah hilir setelah promotor, tetapi sebelum daerah gen struktural, terdapat suatu urutan nukleotida (trpL) yang mengkode suatu polipeptida awal berukuran pendek (leader peptida) yang terdiri atas 14 asam amino dan tidak fungsional sebagai protein. Sekuens gen peptida awal tersebut mempunyai kodon inisiasi translasi AUG diikuti oleh 13 kodon asam amino dan kodon terminasi transalsi UGA. Gen struktural trpE mempunyai kodon inisiasi translasi (AUG) tersendiri yang berbreda dari kodon inisiasi pada sekuens peptida awal. Setelah sekuens trpL terdapat suatu sekuens yang mempunyai fungsi khusus dalam pengendalian dengan mekanisme pelemahan (attenuation) yang disebut sebagai daerah attenuator. Selain itu, juga ada gen regulator operon trp yaitu trpR yang mengkode sintesis aporepresor yang tidak aktif jika tidak ada triptofan.

Pada saat triptofan tidak tersedia, atau hanya tersedia dalam jumlah sangat terbatas, gen trpR hanya menghasilkan aporepresor yang tidak mampu menempel pada daerah operator sehingga RNA polimerase dapat dengan mudah melakukan transkripsi gen-gen struktural trpE, D, C, B dan A setelah melewati daerah attenuator. Sebaliknya, pada saat tersedia triptofan dalam jumlah banyak, aporepresor yang dikode oleh trpR akan berikatan dengan molekul triptofan (disebut sebagai ko-represor) sehingga terjadi perubahan struktural pada protein aporepresor menjadi protein represor yang fungsional. Perubahan struktural tersebut mengakibatkan represor dapat menempel pada daerah promotor operon trp sehingga RNA polimerase tidak dapat melakukan transkripsi gen-gen struktural.

Selain dengan mekanisme pengendalian negatif semacam trp, operon trp juga dikendalikan melalui mekanisme pelemahan. Perlu dipahami bahwa sistem represi operator trp sebenarnya tidak cukup kuat, jauh lebih lemah dibandingkan represor operon lac, sehingga transkripsi gen-gen struktural trp masih dapat terjadi meskipun ada protein represor. Oleh karena itu, diperlukan mekanisme pengendalian yang lain untuk meningkatkan efisiensi selular karena sintesis asam amino triptofan memerlukan banyak energi.

Jika triptofan dalam jumlah banyak, pada awalnya RNA polimerase akan melakukan transkripsi sekuens trpL yang kemudian langsung diikuti dengan transalsi transkrip trpL. Perlu diingat bahwa dalam sistem prokaryot, tarnskripsi akan langsung diikuti dengan translasi, berbeda dengan eukaryot yang memiliki sistem terpisah. Meski trpL dapat ditranskripsi namun proses transkripsi tersebut akan segera diakhiri karena daerah attenuator mempunyai sekuens terminator transkripsi sehingga akhirnya RNA polimerase terlepas dari DNA sebelum mencapai gen-gen struktural trpEDCBA. Sekuens terminator pada daerah attenuator berupa suatu sekuens berulang-terbalik (inverted repeat) yang diikuti oleh delapan pasangan A-T. Dengan adanya sekuens berulang-balik semacam ini, maka transkrip mRNA pada daerah ini akan cenderung mengalami pasangan basa intramolekuler membentuk struktural sekunder jepit rambut (hair pin). Pembentukan struktur jepit rambut yang diikuti dengan rangkaian basa U tersebut menyebabkan ikatan antara transkripsi dengan DNA menjadi tidak stabil sehingga akhirnya transkrip terlepas dan transkripsi tidak dapat dilanjutkan.

Ada 4 sekuens pada daerah peptida awal dan attenuator yang dapat membentuk, struktur sekuens jepit rambut. Proses pelemahan transkripsi ditentukan oleh laju translasi peptida awal, relatif terhadap laju transkripsinya. Sekuens 1 dapat membentuk struktur jepit rambut dengan sekuens 2 (1:2), sedangkan sekuens 3 dengan sekuens 4 (3:4). Struktur jepit rambut 3:4 itulah yang berfungsi sebagai terminator transkripsi sebelum RNA polimerase mencapai gen trpE. Sebaliknya, jika terjadi struktur jepit rambut antara 2:3, maka pembentukan struktur 3:4 dapat dicegah,  sehingga tidak ada terminasi transkripsi dan RNA polimerase dapat berjalan mencapai gen trdEDCBA.

Pengaturan pembentukan struktur sekunder 2:3 atau 3:4 dilakukan dengan mengatur laju translasi peptida awal. Sekuens peptida awal mengandung dua kodon triptofan (UGG) yang terletak berurutan pada sekuens 1. Sekuens 1 tersebut dapat membentuk struktur jepit rambut pertama. Keberadaan dua kodon triptofan yang berurutan semacam ini termasuk jarang karena asam amino triptofan sangat jarang ditemukan pada struktur protein; triptofan umumnya hanya ada satu setiap 100 asam amino. Pada saat triptofan tersedia dalam jumlah sedikit maka jumlah tRNA^trp (tRNA yang membawa asam amino triptofan) juga akan berkurang. Keadaan ini menyebabkan ribosom yang melakukan translasi peptida awal akan berhenti pada daerah kodon triptofan yang pertama sehingga terjadi penumpukan ribosom pada daerah ini. Ribosom yang menumpuk pada sekuens kodon triptofan pertama menyebabkan penghambatan pembentukan struktur jepit rambut 1:2, sehingga sekuens 2 dapat membentuk struktur jepit rambut dengan 3 sekuens (2:3). Akibatnya, struktur jepit rambut 3:4 tidak dapat terbentuk sehingga tidak ada terminasi transkripsi oleh RNA polimerase.

Sejalan dengan proses transkripsi dan translasi gen struktur trpEDCBA, maka asam amino triptofan, meningkat, dengan demikian pula dengan tRNAP. Pada keadaan ini ribosom dapat mencapai daerah terminasi translasi (UGA), yang terletak antara sekuens 1 dan 2, karena tidak ada lagi hambatan akibat keterbatasan triptofan sehingga akhirnya ribosom terlepas. Dengan tidak adanya ribosom maka dapat terbentuk struktur jepit rambut 1:2 dan 3:4, sehingga struktur 3:4 dapat berfungsi sebagai terminator transkripsi oleh RNA polimerase.

Pengendalian operon dengan mekanisme serupa (pelemahan) juga terjadi pada operon his pada E.coli yang mempunyai daerah peptida awal dengan kodon histin berurutan sebanyak tujuh buah. Selain itu, operon lain yang juga dikendalikan dengan mekanisme pelemahan adalah operon thr, ilv, leu, dan phe. Pada bakteri Bacillus substilis, mekanisme pengendalian operon trp, dengan mekanisme pelemahan dilakukan dengan cara yang berbeda. Pada saat triptofan tersedia dalam jumlah banyak triptofan berikatan dengan suatu protein yang disebut sebagai TRAP dapat  melekat pada RNA-biding atteniator protein). Pengikatan ini menyebabkan TRAP dapat melekat pada RNA hasil transkripsi gen peptida awal menyebabkan terbentuknya terminator sehingga transkripsi gen-gen trp tidak terjadi. Sebaliknya, pada saat triptofan tidak, tersedia dalam jumlah banyak, TRAP tidak dapat berikatan dengan transkrip gen peptida awal sehingga terbentuk terminator.

F.     Pengendalian Operan ara

            Katabolisme L-arabinosa oleh E-coli melibatkan tiga enzim yang dikode oleh tiga gen berurutan, yaitu araB, araA, dan araD. Aktivitas transkripsi ketiga gen tersebut diatur oleh gen keempat yaitu araC. Lokus araC dan araBAD ditranskripsi dengan arah yang berlawanan oleh suatu daerah promotor sentral. Aktivitas ipromotor araC (P_c) maupun promotor araBAD (P_BAD) distimulasi oleh CAP-cAMP. Operon ara mempunyai dua operator yaitu araO₁ (mengendalikan araC) dan araO₂ (mengendalikan araBAD). Operator araO₂ terletak cukup jauh dari promotor P_BAD (pada posisi-265 dan -294) tetapi masih mampu melakukan pengendalian transkripsi. Sisi pengikatan CAP terletak sekitar 200 bp disebelah hulu dark promotor ara. Protein araC (dikode oleh araC) mempunyai 3 daerah pengikatan yaitu pada araO₂, araO_l, dan pada aral yang dapat dibedakan menjadi dua sub-bagian yaitu aral₁ dan aral₂.

Pada saat tidak tersedia arabinosa, sehingga tidak diperlukan enzim untuk katabolisme, protein araC melakukan pengendalian negatif dengan cara menempel pada araO₂ dan aral₁. Penempelan itu menyebabkan DNA membengkok sehingga menekan transkripsi operon araBAD. Sebaliknya, jika arabinosa tersedia, terjadi perubahan konfirmasi protein araC sehingga protein regulator tersebut tidak dapat menempel pada araO₂ melainkan melekat pada aral₁ dan aral₂. Hal ini menyebabkan penghilangan struktur bengkokkan DNA yang sebelumnya menekan operon ara BAD sehingga operon ini dapat ditranskripsi dan translasi menghasilkan enzim-enzim yang digunakan untuk metabolisms arabinosa.

Protein araC sendiri juga dapat diatur aras sintetisnya dengan mekanisme autoregulasi. Gen araC ditranskripsi kearah kiri dari promotornya (P_C) sementara disemailah kirinya (disemailah hulu dari araC) terdapat operator araO₁. Pada saat konsentrasi araC meningkat, protein ini akan menempel pada araO₁ sehingga  akhirnya menghambat transkripsi araC kearah kiri (kearah hulu dari lokus araC). Penghambatan transkripsi araC ini pada akhirnya akan mengurangi jumlah protein represor sehingga tidak disintesisi dalam jumlah berlebihan.

G.    Pengendalian Operon gal

            Operon gal pada E. coli terdiri atas tiga gen struktural, yaitu galE, galT, dan galK yang ditranskripsi dari dua promotor yang saling tumpang tindih pada sisi sebelah hulu dari galE. Operon ini selain bertanggung jawab dalam metabolisme galaktosa sebagai sumber karbon, juga berperan dalam mengubah UDP-glukosa menjadi UDP-galaktosa pada waktu tidak ada galaktosa. Meskipun transkripsi kedua promotor gal dapat diinduksi oleh galaktosa, tetapi produk galE dalam aras dasar selalu dibutuhkan pada saat tidak tersedia galaktosa. Operon gal juga diatur oleh sistem represi katabolic. Pada saat konsentrasi cAMP tinggi, kompleks CAP-cAMP akan menstimulasi transkripsi dari promotor pertama sekaligus menekan promotor kedua sehingga terbentuk produk gen-gen struktural operon gal. Sebaliknya, jika bakteri ditumbuhkan dalam medium yang mengandung glukosa, sehingga konsentrasi cAMP rendah, maka transkripsi dimulai dari promotor kedua yang terletak disemailah hulu promotor pertama. Keadaan ini menyebabkan disintesisinya enzim-enzim gal pada aras dasar (basal level). Kedua promotor gal tersebut dikendalikan secara negatif oleh produk gen galR yang tidak terikat dengan operon gal.

  

A.    Kesimpulan

1.      Operon adalah kelompok gen pada prokariotik yang diekspresikan secara bersama-sama dengan menggunakan suatu promotor yang sama

2.      Dua sistem regulasi yang paling umum dilakukan pada bakteri, yaitu system operan laktosa (operan lac) dan system operan triptopan (operan trp).

3.      System operon lac adalah system pengendalian ekspresi gen-gen yang bertanggung jawab di dalam metabolisme laktosa.

4.      Operon trp berperanan di dalam sintesis asam amino triptofan pada E. coli. Operon trp, dikendalikan melalui dua macam mekanisme yaitu : (1) penekanan (represi) oleh produk akhir ekspresi, dan (2) pelemahan (attenuation).

5.      Katabolisme L-arabinosa oleh E-coli melibatkan tiga enzim yang dikode oleh tiga gen berurutan, yaitu araB, araA, dan araD. Aktivitas transkripsi ketiga gen tersebut diatur oleh gen keempat yaitu araC. Lokus araC dan araBAD ditranskripsi dengan arah yang berlawanan oleh suatu daerah promotor sentral.