Rolling Circle Replication

Rolling circle replication

A.      Phage ФX174 dan Rolling Circle Replication

Ada jasad yang mempunyai genom berupa molekul DNA untai ganda (double-stranded), untai-tunggal (single-stranded), bahkan berupa molekul RNA. Jasad yang mempunyai genom berupa untai-tunggal adalah sekelompok virus tertentu, misalnya ФX174. Virus ФX174 adalah virus yang menginfeksi bakteri (sehingga disebut sebagai bakteriofag). Virus ini merupakan salah satu virus berukuran paling kecil (Gardner, 1991).

Genomnya berupa molekul DNA untai-tunggal berbentuk lingkaran yang tersusun atas 5.386 nukleotida. Genom virus ini hanya mengkode 11 protein, tetapi mengandung gen-gen yang tumpang tindih (overlapping genes). Sebagai contoh, gen A* terdapat di dalam gen A, dan gen E terdapat di dalam gen D. Replikasi genom virus ini sangat tergantung pada sistem replikasi sel inangnya yaitu bakteri E.coli (Yuwono, 2005).

Bakteriofag ФX174 menginfeksi inang dalam hal ini adalah E.coli, virus dengan DNA rantai tunggal yang disebut sebagai untaian positif (+) diubah menjadi rantai ganda yang disebut RF (Reflication Form) dengan cara mensintesis untaian (-) yang komplemen. Untaian ganda ini bereplikasi beberapa kali untuk membentuk sekumpulan molekul RF anakan (untaian ganda) yang bereplikasi secara tidak simetris untuk menghasilkan sekelompok virus anakan untaian positif (+). Untaian virus anakan membentuk selubung protein untuk melengkapi siklus reproduksi. Pada akhir tahap kedua, sintesis DNA terjadi melalui mekanisme yang berbeda disebut  rolling circle replication. (Gardner, 1991).

Pada saat virus ini menginfeksi E.coli, DNA-nya akan diinjeksikan ke dalam sel inang. Molekul DNA yang diinjeksikan tersebut disimbolkan dengan untaian positif (+). Untaian positif (+) inilah yang mengandung informasi genetik virus tersebut. Sekitar 20-30 menit setelah DNA virus diinjeksikan ke dalam sel inang, protein A* yang dikode di dalam genom virus disintesis di dalam sel E.coli. Protein A* tersebut akan menghambat sintesis DNA di dalam sel inang. Untaian positif (+) ini akan menjadi cetakan dalam proses replikasi DNA virus sehingga akan dihasilkan untaian komplemennya, yaitu untaian negatif (-). Untaian negatif (-) tersebut selanjutnya akan menjadi cetakan untuk menghasilkan untaian positif (+).

Rolling circle replication dimulai ketika aktivitas spesifik enzim nuklease dari virus ФX174 itu protein membelah rantai positif dari rantai induk RF pada daerah ori dari reflikasi. Aktifitas enzim ini sangat spesifik dengan memotong kromosom hanya pada satu sisi pada daerah ori. Enzim tersebut membentuk ujung 3’OH dan 5’Phosfat pada sisi yang dipotong itu pada untai positif dan untai negatifnya tetap utuh. Ujung 5’ dari untai positif tersebut terbuka dan terlepas sementara untai negatifnya berputas disekitas daerah aksis (sehingga namanya disebut rolling circle) (Gardner, 1991).

B.       Mekanisme Rolling Circle Replication

Menurut Gardner (1991) Replikasi kromosom bakteriofage ФX174 terbagi dalam tiga tahapan yaitu: (1) Untaian positif induk → RF induk, (2) RF induk → RFs anakan, dan (3) RFs anakan → untaian positif anakan. Untuk lebih jelasnya mengenai mekanisme rolling circle replication disajikan pada gambar berikut:

Mekanisme Rolling Circle Replication

(Sumber: http://www-archbac.u-psud.fr/Graphics/Graz96/rcr.gif)

Mekanisme Rolling Circle Replication

(Sumber: Gardner, 1991)

Keterangan: Mekanisme Rolling Circle Replication pada bakteriofag ФX174 yaitu:

1.    Tahap I. Conversi  kromosom untai tunggal menjadi induk untai ganda. (a-e) dari untai tunggal menjadi induk untai ganda (RF), (b) Sintesis untai (-) komplemen diinisiasi oleh sintesis primer RNA pendek, reaksi dikatalis oleh primosom yeng membutuhkan complek paling tidak 6 protein yang berbeda, komplemen ini disebut primosom. (c) DNA polimerase III mengkataklisis covalen tambahan dari DNA sampai unung 3’ dari RNA primer. Sintesis untai (-) komplemen itu terjadi secara  terus menerus sampai cetakan untai positif habis. Primosom bergerak di sekitar untai cetakan silkuler, setelah berhenti sebentar kemudian menginisiasi sintesis fragmen okazaki yang baru. (d) Pemotongan primer RNA pada celah-celah diantara fragmen-fragmen okazaki tersebut diisi oleh aktivitas DNA polimerase I. DNA ligase kemudian mengkatalisis ikatan kovalen diantara 3’OH dan 5’OP untuk menghasilkan induk untai ganda (RF).

2.    Tahap II. Rolling circle Replication dari induk RF untuk menghasilkan kumpulan anakan RFs (e). (f) induk untai (+) RF dipotong pada bagian ori dengan menggunakan enzim nuklease dari ФX174 protein gen A. lubang protein gen A pada induk RF terletak hanya pada ori dan tidak akan memotong molekul DNA sama sekali. (f-h) selama peristiwa protein gen A menjadi ikatan kovalennya bertambah pada group 5’ pada untai (+). Hal ini menyisakan sambungan menuju 5’ sampai untai positif anakan disintesis dengan sempurna. (g) Ujung 5’ pada untai positif  dipindahkan dari untai (-) dan DNA ditambahkan pada 3’OH membentuk lingkaran. (g-h)  Protein gen A menyisakan ikatan pada garpu replikasi untuk pergerakannya di sekitar untai negatif (-). (h-i) Sekali untai positif (+) baru disintesis protein gen A membelah daerah permulaan dan secara simultan menyambung ujung 3’ dan 5’ untuk membentuk untai positif silkular menjadi lebih rapat. (i-l) Sintesis untai negatif (-) komplemen terjadi secara tidak terus menerus seperti pada tahap I dengan menggunakan untaian positif sebagai cetakan. Fragmen-fragmen okazaki diinisiasi oleh RNA primer namun RNA primer tersebut tidak tampak pada diagram. (i-f-l) Induk RF terus bereplikasi dengan cara rolling circle sampai populasi anakan RFs sebanyak 60.

3.    Tahap III. Sintesis kromosom anakan untai tunggal. (l-p) Rolling circle replication dari anakan RFs terjadi hanya pada induk RFs pada tahap 2, kecuali jika untai negatif tidak disintesis, sebagai penggantinya untai positif dibungkus dalam virion. (n-p) dari sintesis RF (tahap 2) menjadi anakan untai positif pada tahap 3 dihasilkan dari sintesis gabungan lapisan protein virus yang terdapat pada untai positif, yang mencegahnya dari cetakan yang sesuai bagi untai negatif. (q) Pematangan anakan virus akan sempurna  pada siklus hidup bakteorifag ФX174. Sekitar 500 anakan virus dihasilkan per sel yang terinfeksi.

Pertanyaan Rolling circle replication

1. Apa sajakah bukti-bukti dari penemuan Rolling Circle Replication?

Jawab: Bukti-bukti terjadinya Rolling circle replication ditemukan pada (1) DNA virus untai tunggal seperti ФX174, (2) Replikasi behubungan dengan transfer kromosom selama fase “mating” (konjugasi) pada bakteri, dan (3) replikasi pada molekul DNA ekstra kromosom yang membawa gen-gen rRNA selama oogenesis pada ampibi.

2. Sebuah molekul DNA melingkar berisi 1 juta pasangan basa. Jika DNA sintesis dengan garpu replikasi terjadi pada tingkat nukleotida 100.000 per menit, berapa lama replikasi theta membutuhkan untuk sepenuhnya mereplikasi molekul, dengan mengasumsikan bahwa theta replikasi adalah dua arah? Berapa lama replikasi ini kromosom melingkar mengambil dengan rolling circle replication? Mengabaikan replikasi untai pengungsi di rolling-circle replication.

Jawab: Dalam replikasi dua arah ada percabangan replikasi dua, masing-masing melanjutkan pada laju 100.000 nukleotida per menit. Oleh karena itu, akan membutuhkan 5 menit untuk molekul DNA sirkular yang akan direplikasi oleh replikasi dua arah karena percabangan masing-masing dapat mensintesis 500.000 nukleotida (5 menit x 100.000 nukleotida per menit) dalam periode waktu. Karena rolling circle replication dan dengan demikian hanya satu percabangan replikasi, 10 menit akan dibutuhkan untuk meniru molekul melingkar keseluruhan.